酸奶单增李斯特菌检测

检测背景

单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是国际公认的四大食源性致病菌之一，具有耐低温特性（可在 4℃冰箱中生长），酸奶生产过程中若原料乳灭菌不彻底、生产环境清洁不到位，或包装后二次污染，都可能导致该菌残留。

我国《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》（GB 4789.30）明确规定了乳制品中该菌的检测方法，以确保产品安全性。

检测原理

基于单增李斯特菌的生物学特性设计检测流程：

生理特性：该菌在含吐温 80 的培养基中可生长，能发酵多种糖类（如葡萄糖、麦芽糖），且具有动力（在半固体培养基中呈伞状扩散生长）。

生化特性：能产生李斯特菌溶血素 O（LLO），在血琼脂平板上形成透明溶血环；触酶试验阳性，氧化酶试验阴性。

分子生物学特性：通过 PCR 扩增其特异性基因（如hlyA、inlA），可快速鉴定菌种。

检测流程

1. 样品前处理

无菌操作称取 25g 酸奶样品，放入 225mL 灭菌生理盐水（或磷酸盐缓冲液）中，用均质器充分混匀，制成 1:10 样品匀液。若样品黏稠（如凝固型酸奶），需先温热至室温并搅拌均匀，避免颗粒影响后续培养。

2. 增菌培养

前增菌：取 10mL 样品匀液加入 90mL 含抗生素（如放线菌酮、萘啶酮酸）得 LB1 增菌液中，30℃培养 24 小时。抗生素可抑制杂菌生长，促进单增李斯特菌复苏繁殖。

选择性增菌：从 LB1 培养液中取 0.1mL 转接入 10mL LB2 增菌液（含更高浓度抗生素），30℃再培养 24 小时，进一步富集目标菌。

3. 分离纯化

用接种环取增菌液划线接种于 PALCAM 琼脂（含氯化锂、多粘菌素 B 等抑制剂）或牛津琼脂平板，37℃培养 24-48 小时。

单增李斯特菌在 PALCAM 平板上形成灰绿色菌落，周围有黑色沉淀环；在牛津平板上呈黑色菌落，外围有白色晕圈。

挑取可疑菌落（至少 5 个），接种于 TSA-YE 琼脂平板（含酵母提取物），37℃纯化培养 24 小时，获得单菌落。

4. 初步鉴定

动力试验：取单菌落穿刺接种于半固体琼脂（含 0.3% 琼脂），25℃培养 24 小时，单增李斯特菌因鞭毛运动呈伞状扩散生长，而大多数杂菌无此特性（4℃培养动力更明显）。

溶血试验：将菌落接种于血琼脂平板（含 5% 绵羊血），37℃培养 24 小时，单增李斯特菌产生 LLO 溶血素，形成透明溶血环（需与金黄色葡萄球菌等溶血菌区分）。

生化试验：进行触酶试验（阳性，产生气泡）、氧化酶试验（阴性）、糖类发酵试验（葡萄糖、麦芽糖阳性，蔗糖阴性等），初步判断是否为李斯特菌属。

5. 确证鉴定

血清学试验：用单增李斯特菌标准血清（如抗 O 抗原血清）进行凝集试验，确定血清型（常见血清型为 4b、1/2a 等）。

分子生物学试验（可选）：提取可疑菌落 DNA，采用 PCR 扩增基因（编码 LLO 溶血素），通过琼脂糖凝胶电泳观察目标条带，或用实时荧光定量 PCR 快速检测，提高特异性和灵敏度。

注意事项

生物安全：单增李斯特菌为致病菌，操作需在生物安全柜（BSC-Ⅱ 级）中进行，废弃物需经高压灭菌（121℃，15 分钟）后处理，避免环境污染。

低温控制：增菌培养温度严格控制在 30℃（非 37℃），因该菌在 30℃以下动力更明显，且可抑制部分杂菌生长；

样品储存和运输需保持 4℃冷链，防止菌数下降或死亡。

假阳性与假阴性：某些李斯特菌属（如英诺克李斯特菌）不致病，需通过生化试验或分子生物学方法与单增李斯特菌区分；

增菌液抗生素浓度不足可能导致杂菌过度生长，掩盖目标菌，需定期验证培养基和试剂有效性。

环境监测：除成品检测外，需对酸奶生产线（如灌装头、冷藏库）、工器具进行涂抹采样，监测环境中李斯特菌污染情况，从源头控制风险。

快速检测技术延伸

随着检测技术发展，免疫磁珠分离（IMS）结合 ELISA、胶体金免疫层析等方法可缩短检测时间（传统方法需 4-7 天，快速法可在 24-48 小时内完成）。

例如，用包被抗单增李斯特菌抗体的磁珠捕获菌细胞，通过荧光标记抗体直接观察，或利用核酸等温扩增技术（如 LAMP）在恒温条件下快速扩增靶基因，适用于批量样品筛查，为酸奶生产过程中的质量控制提供更高效的手段。