一、实验原理

‌低温保存机制‌：通过梯度降温（-1℃/min）将细胞置于液氮（-196℃）环境，抑制细胞代谢活动，结合DMSO等冷冻保护剂减少冰晶损伤，实现长期保存‌。

‌保护剂作用‌：DMSO穿透细胞膜降低冰点，防止细胞内大冰晶形成，维持细胞膜完整性和渗透压稳定‌。

二、实验步骤

‌细胞准备‌

选择对数生长期细胞（活力＞90%），冻存前24小时更换新鲜培养基以增强细胞活性‌57。

消化细胞：使用含EDTA的胰酶（0.25%）消化至细胞变圆，立即加入完全培养基终止反应，离心（800-1000rpm，5分钟）收集细胞‌。

‌冻存液配制‌

‌常用配方‌：90%完全培养基 + 10% DMSO + 10-20%胎牛血清（FBS），现配现用并预冷至4℃‌。

‌浓度控制‌：细胞悬液密度调整至1-5×10⁶ cells/mL，分装至冻存管（每管0.5-1 mL）‌。

‌梯度降温‌

‌程序降温法‌：冻存管放入程序降温盒（-1℃/min）转移至-80℃过夜，次日转存液氮‌。

‌传统方法‌：4℃（30分钟）→ -20℃（30分钟）→ -80℃（过夜）→ 液氮长期保存‌。

三、关键注意事项

‌操作规范‌

‌全程避光‌：DMSO对光敏感，冻存液配制及细胞重悬需避光操作‌。

‌标记明确‌：冻存管标注细胞名称、代数、冻存日期及操作者，使用耐低温标签‌。

‌质量控制‌

‌污染检测‌：分装前取少量细胞悬液进行微生物污染检测‌。

‌复苏验证‌：随机抽样冻存细胞复苏后检测存活率（台盼蓝染色＞80%）‌。

‌风险规避‌

‌避免反复冻融‌：每支冻存管仅解冻一次，防止细胞损伤‌。

‌液氮安全‌：佩戴防冻手套操作液氮罐，防止冻伤和冻存管爆裂‌。

四、应用案例

‌临床级冻存‌：VUM03注射液（脐带源间充质干细胞）通过程序化冻存技术实现临床级细胞制剂长期保存‌。

‌免疫治疗‌：冷冻保存的CAR-T细胞复苏后仍保持抗肿瘤活性，临床治疗血液肿瘤效果与新鲜细胞无显著差异‌。