一、常用荧光检测方法

‌Annexin V-FITC/PI双染法‌

‌原理‌：Annexin V结合凋亡细胞外翻的磷脂酰丝氨酸（PS），PI标记坏死细胞破损的细胞膜，区分早期凋亡（Annexin V⁺/PI⁻）、晚期凋亡（Annexin V⁺/PI⁺）及坏死细胞（Annexin V⁻/PI⁺）‌。

‌适用样本‌：贴壁细胞、悬浮细胞‌。

‌TUNEL法（DNA断裂标记）‌

‌原理‌：利用TdT酶将荧光标记的dUTP连接到凋亡细胞DNA的3'-OH末端，直接标记DNA断裂位点‌。

‌适用场景‌：组织切片、细胞涂片‌。

‌Hoechst 33258/PI双染法‌

‌原理‌：Hoechst 33258穿透活细胞膜标记浓缩的凋亡细胞核（亮蓝色荧光），PI仅标记坏死细胞核（红色荧光）‌。

二、实验步骤（以Annexin V-FITC/PI法为例）

‌细胞处理‌

‌悬浮细胞‌：1000g离心5分钟收集，PBS洗涤2次‌。

‌贴壁细胞‌：胰酶（不含EDTA）消化后终止，PBS洗涤并制备单细胞悬液‌。

‌染色与孵育‌

加入195μL Binding Buffer重悬细胞，依次加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI染色液，避光室温孵育10-20分钟‌。

‌检测与分析‌

流式细胞术‌：设置FITC（Ex 488 nm/Em 530 nm）和PI（Ex 535 nm/Em 617 nm）通道，分析各象限细胞比例‌。

‌荧光显微镜‌：直接观察绿色（Annexin V⁺）和红色（PI⁺）荧光信号分布‌。

三、关键注意事项

‌样本制备‌

避免消化过度：胰酶处理时间≤2分钟，防止假阳性凋亡信号‌6。

固定与通透：TUNEL法需4%多聚甲醛固定15-20分钟，0.2% Triton X-100通透10分钟‌。

‌染色优化‌

避光操作：所有荧光染料需全程避光保存和使用‌。

浓度控制：Hoechst 33258染色浓度5-10μg/mL，孵育时间≤10分钟‌。

‌干扰排除‌

设置阴性对照：不含TdT酶的TUNEL反应液验证非特异性标记‌。

排除死细胞干扰：流式检测前用PI预染筛选活细胞群体‌。

四、结果判读标准

‌检测方法‌           ‌       活细胞‌       ‌                   早期凋亡‌                      晚期凋亡/坏死‌

Annexin             V/PI双染 Annexin        V⁻/PI⁻ Annexin          V⁺/PI⁻ Annexin V⁺/PI⁺

Hoechst/PI双染   弱蓝色均匀核            亮蓝色碎片化核                    红色核

TUNEL法              无绿色荧光               绿色荧光聚焦点                 强绿色弥散信号

五、应用案例

‌药物筛选‌：Annexin V/PI法验证化疗药物（如顺铂）诱导肿瘤细胞凋亡率提升＞40%‌。

‌机制研究‌：TUNEL法显示凋亡抑制剂（Z-VAD-FMK）可显著减少神经元DNA断裂信号‌。